HRP快速标记试剂盒

HRP快速标记试剂盒产品说明书

 在您使用本产品前请认真阅读说明书，这对您顺利完成实验很有帮助。

产品货号：6210-0.5MGX2

产品名称：HRP快速标记试剂盒（最小可标记量为0.1mg）

原理与应用：高碘酸钠氧化法活化辣根过氧化物酶（HRP）的糖基，经过活化的HRP带有醛基可以与待标记物的游离氨基结合，发生希夫碱反应（Schiff's base reaction）。本试剂盒适用于带有游离氨基的物质的标记，比如：带有游离氨基（伯胺）的抗体、蛋白或者小分子化合物。本试剂盒采用特有稳定技术，活化HRP保存在液体中，吸取方便，最小可以标记100μg，让您的标记工作更易把控和操作！

试剂盒组成：

操作步骤：

1. 首先去除待标记抗体或蛋白中的叠氮钠、以及含有氨基的缓冲成分物质，比如甘氨酸、Tris 等，还有EDTA等物质，可采用透析和超滤的办法置换缓冲液，以去除干扰物质达到最佳标记效果！透析或超滤缓冲液首选0.01M CB,PH:9.6缓冲液(说明书附件有经验配方无需调整PH），若实验室没有碳酸盐试剂再采用0.01M PBS（PH:7.0-7.4均可）透析或超滤置换缓冲液，最后调整抗体或蛋白的浓度到2mg/mL。如果抗体和蛋白不含上述这些干扰物质可以直接用上述PBS或CB缓冲液调整浓度到2mg/mL备用。

2. 从4℃取出HRP标记试剂盒，使各组分充分混匀。

3. 取250μL抗体或蛋白（约0.5mg），加入50μL预活化HRP(0.5mg)液体中，用移液枪反复吹打几次混匀，混匀后加入HRP标记启动液54μL（加入启动液量依据：每10μL蛋白和HRP混合液加1.8μL启动液）继续混匀数次，避免产生气泡。然后避光30℃-37℃温箱偶联反应2-3小时，若遇快要下班也可放4℃反应24小时左右（此法效果一样或者更好不必担心）。

4. 偶联结束将反应终止液粉管中加入1mL去离子水混匀，取25μL加入3所述反应液中（加入终止液量依据：每1mg HRP加入终止液50μL），充分混匀，室温放置1 小时或者4℃ 2小时。

5. 终止完成后，可直接加入等体积的标记物保存液，充分混匀，置于-20℃保存。如果想更上长期的保存建议先用0.067M PBS  PH:7.0（说明书附件有经验配方）透析或超滤置换缓冲液后再加标记物保存液。这样可以保存3年左右甚至更长。

注意事项：

1. 待标记物缓冲液成分过于复杂以及含有氨基小分子和NAN3的初始缓冲液必须透析或超滤置换掉，请采用0.01M PBS（PH:7.0-7.4均可）或0.01M CB,PH:9.6缓冲液均可。

2. 如果待标记物不是抗体是其它蛋白，那么请根据分子量参考蛋白和酶用量：若分子量在40KD以上建议1mg蛋白使用1mg HRP；如果分子量在30KD左右，建议1mg蛋白使用1.3mg HRP；如果分子量在20KD左右，建议1mg蛋白使用2mg HRP；如果分子量在10KD左右，建议1mg蛋白使用4mg HRP；此时启动液和终止液请按步骤3和4描述标准适量加入；如果标记量为小于0.5mg的抗体或蛋白（最小可以0.1mg），HRP和其它试剂加入量按比例折算即可。

3. 小分子药物不建议直接标记HRP，因为HRP的结构不能结合足够的药物会造成效价偏低，这种情况建议先偶联BSA增加小分子偶联量再进行HRP标记，这样效果会非常好。

4. 如果待标记物含有其它蛋白需要把无关蛋白同样计算进去，尽快如此也请您慎重选择这样的样品进行标记。

5. 本试剂盒保存4℃可以保证1年内开启有效，活化HRP开启后小心取用切勿污染碱性物质。

6. 终止液干粉一共2支，原则上每一支配好后仅限一次性使用，因此您可以根据您的实验总量合理配制使用。

附件：

1. 0.01M  CB ，PH:9.6缓冲液配制：取NaHCO3, 0.67g和Na2CO3, 0.21g加水到1L溶解完全即可，不用调节PH。

2. 0.067M PBS,  PH:7.0缓冲液配制：取NaH2PO4·2H2O，5.35g和Na2HPO4·12H2O, 11.7g以及NaCL，9g加水1L溶解完全，最后添加NaOH，0.35g再次混匀后即可，不用再调节PH。