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导读
• 蛋白质从头测序是什么？
• 蛋白质从头测序分析流程是什么？
• 蛋白质从头测序数据分析的理论基础是什么？
一、蛋白质从头测序的原理
简单来说蛋白质从头测序就是不依赖于任何现有的DNA或者蛋白质的数据库信息，直接对蛋白质氨基酸序列进行测定。蛋白质从头测序的原理是基于蛋白酶切后的肽段分子在质谱检测中有规律性的断裂，找到特定断裂模式，再根据质谱峰之间质量差即可算出对应的氨基酸信息，以及氨基酸上的翻译后修饰。
蛋白质从头测序的优势特点
蛋白质从头测序法的一大特点就是可以不借助任何蛋白质或者DNA数据库信息，直接对蛋白质的序列进行分析。相比传统的质谱数据库搜索法有着不可比拟的优势，那就是从头测序法可以应用于分析新物种的蛋白质序列，以及基因组未被测序的物种的蛋白质序列。
二、蛋白质从头测序的分析流程
图1. 蛋白质从头测序的分析流程图
蛋白质从头测序的分析流程
1. 使用蛋白酶对分离纯化后的待测蛋白质样品进行酶切，将蛋白质剪切成一定大小的多肽片段。（可以分别选用多种蛋白酶进行酶切，以确保蛋白质的全序列可以被鉴定分析到）
2. 使用高效液相色谱对肽段酶切产物进行分离纯化，这样有利于接下来更为高效准确的质谱分析。
3. 被分离的肽段再经由质谱分析前shǒu先经过软电离处理使肽段带上一定量的电荷，接着飞行进入质谱仪。shǒu先经过一级质谱对肽段离子进行筛选。
4. 经过一级质谱筛选后的肽段分子，再进入碰撞室，与室内的碰撞气体（常用的碰撞气体通常有He，Ar，Xe，CH4等惰性气体）进行碰撞诱导肽段共价键断裂，产生子离子，再经由二级质谱（MS2）分析肽段序列。
5. 借助特定软件对各个肽段的二级质谱峰进行从头序列分析，再对肽段序列拼接获得蛋白质全长序列。
上面我们讲到了蛋白质从头测序的分析流程，熟悉质谱鉴定的同学能够发现，蛋白质从头测序的实验流程与常见的串联质谱分析大同小异，那么大家看到这可能想要问了，那么蛋白质从头测序法究竟是如何实现直接对蛋白质的序列进行分析的呢？其实，从头测序分析的核心就在于对二级质谱峰的数据分析上面。那么接下来，小编就给大家详细地介绍从头测序数据分析的基础原理。
三、蛋白质从头测序数据分析原理
小编在文章前面介绍蛋白从头测序的原理时，也提到过蛋白质从头测序分析的理论基础是基于肽段在二级质谱诱导碎裂时是有规律地断裂的。根据肽段断裂的位置，可以产生不同种类的离子，在靠近N端的地方断裂产生的离子有a，b，c三种类型的离子，在靠近C端的地方断裂产生的离子有x，y，z三种类型。以N端断裂离子为例，其中a型离子由第yī个氨基酸C=O前面的C-C键断裂产生的N端离子，b型离子是由第yī个氨基酸和第二个氨基酸之间的C-N键断裂产生N端离子，c型离子是由第二个氨基酸的N-C键断裂形成的（如图2所示）。对于N端端裂的离子来说，断裂的位置不同产生多种不同的a，b，c型离子，为了进一步对在不同的断裂点产生的同一类型的离子进行区分，每个离子下方都标记了罗马数字指代断裂的位置。（如图2，a1，a3指代断裂位置不同的同一类a型离子）
图2. 肽段断裂产生的子离子类型
介绍完肽段碎裂的规律后，我们可以发现每个肽段碎裂产生的离子都有各自的特点，其中b型离子较为特殊，因为b型离子断键的位置位于两个氨基酸残基之间，因此每两个相邻的b离子的质量差等于NH2C2O-R（如图3所示）。不同的氨基酸的R基质量是不同的，因此，如果能够在二级质谱的众多质谱峰中确定b离子的峰图，根据出两个相邻的b型离子的质量差，就可计算出R基的质量大小，然后根据R基即可确定对应的氨基酸。除此之外，如果氨基酸残基上有翻译后修饰，也可以使用b型离子间的质量差来计算翻译后修饰的质量，从而推算可能的翻译后修饰。
图3. b型离子断裂模式
由于经过一次碎裂碰撞，大多数肽段只会有一处断裂，因此，只要在二级谱图中找到b型离子的分布图谱，那么每两个b型离子的质量差就是氨基酸的质量，我们可以使用这一信息找到质量匹配的氨基酸。
但是从二级谱图中众多的离子峰来确定b型离子的质谱峰，涉及到复杂的建模以及概率推算，因此，依靠人工的方法选择b型离子的峰图是不现实的，目前有许多从头测序分析的软件可以帮助我们完成这一步骤，例如， PEAKS和NovoHMM等。不同的软件对b型离子图谱推算原理各有不同，但都是推测的数据需要与实际测得的图谱进行多次比对，才能实现对序列的精准无误的分析。
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基于生物化学、分子生物学、色谱的检测分析平台：该平台配备了Agilent 2100 生物分析仪、 ProteinSimple凝胶成像系统、高效液相色谱系统，为蛋白质组学、代谢组学分析保驾护航，包括样品制备、分离纯化、分子量测量、杂质表征表达研究等；
基于质谱技术的蛋白质组学分析平台、代谢组学分析平台、蛋白测序平台：该平台配备了超高效液相色谱质谱联用，Orbitrap Fusion Lumos Tribri，Thermo Scientific Exploris以及氢氘交换质谱仪配合机械臂为蛋白质组学、代谢组学和蛋白测序提供了全面的分析手段，包括蛋白质和代谢物的分离、质谱分析、结构分析以及动态信息研究；
生物药物表征平台： 该平台配备了DSC-FTRR差示扫描量热仪与傅立叶变换拉曼光谱仪，氢氘交换质谱仪配备机械臂，为生物药物表征提供了全面的分析手段，包括生物药物的分离、纯化、结构分析和动态信息研究；
基于10x Genomics的单细胞分析平台：该平台能够完成基于10x Genomics单细胞分析平台的检测流程，包括单细胞分选、cDNA合成、文库制备、文库质量检测、PCR扩增以及高通量测序；
基于Fluidigm的单细胞质谱流式检测平台：采用基于Fluidigm Helios流式细胞仪（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于单细胞质谱分析，该平台能够完成包括单细胞捕获、cDNA合成、实时定量PCR分析、目标区域扩增以及质谱流式细胞分析；
基于高精度质谱的免疫多肽组学及免疫学检测平台：基于高精度质谱的免疫多肽组学及免疫学检测平台，能够完成包括多肽分离、纯化、合成、质谱分析、免疫学检测以及分子相互作用研究；
生信云平台：基于生物信息分析方法的生信云平台，能够完成一整套的生物信息学解决方案，包括组学数据的质量分析、差异表达分析、差异表达物GO、KEGG、COG注释分析、聚类分析、相互作用网络等多层次网络和通路的分析。
一、蛋白测序
蛋白测序服务两种主要分析方法
E蛋白测序服务两种主要分析方法：Edman降解（Harvey和Ferrier，2011； Bauer等，1997）和质谱分析（MS）（Sahukar等，2016）。蛋白质测序和鉴定常用质谱法，Edman降解法是表征蛋白质N端重要的方法之一。
百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司Edman降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于Edman降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。
蛋白测序服务流程
蛋白测序服务优势
1 .采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;
2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;
3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;
4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;
5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;
6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。
二、蛋白质组学
蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。确实，那些世界范围内销路好的药物本身是蛋白质或其作用靶点为某种蛋白质分子。因此，蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益。蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。
不同技术的比较
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蛋白质组学服务 |
特点 |
技术要点 |
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Label-free |
非标蛋白质组学 |
无需对样品标记处理； 操作简单； 可大规模分析蛋白质鉴定样品，对样品数量无限制。 |
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iTRAQ/TMT |
体外标记定量蛋白质组学 |
可同时定量分析 2-10 个样品； 体外标记，不受样品类型限制； 可鉴定多达6000个蛋白； 实验稳定度和重复度较高。 |
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SILAC/Dimethyl |
体内标记定量蛋白质组学 |
可对比23 个样品； 体内标记，标记稳定，组间误差小； 需要的样本量较小，仅需几十微克的蛋白。 |
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SWATH |
DIA 全景蛋白质组学 |
全景式、高通量、非质谱依赖的数据采集手段； 数据采集精准高效，线性范围； 检测蛋白丰度跨越 4个数量级； 可分析多达 2000 个蛋白质。 |
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MRM |
绝对定量蛋白质组学 |
基于已知质谱信息来对目标分子进行分析的手段； 检测精准高效，可进行绝对定量分析； 实验结果重现性好，准确度高； 可精准鉴定低丰度蛋白。 |
蛋白质组学服务优势
1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;
2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;
3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;
4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;
5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。
三、单细胞质谱流式技术分析
单细胞质谱流式（Mass Cytometry）技术利用质谱技术对单细胞进行多参数检测，既有传统流式细胞术能够高速分析的特点，又兼并了质谱检测的高分辨能力。能够指定检测蛋白，避免漏掉丰度很低但又很重要的蛋白，且质谱流式技术通量相当高，可以实现大量细胞的检测。
百泰派克生物科技单细胞质谱流式分析方案
百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。
单细胞质谱流式服务优势
①技术先进，填补技术空白
采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。
②分析数量大，成本较低
单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。
③应用前景大
a)流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；
b)将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；
c)可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。
四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现
百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。
基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现分析策略
结果交付
1.所有鉴定的免疫多肽列表，新抗原肽以及肿瘤相关抗原肽列表；
2. 免疫多肽组数据质量分析，如研究案例中的数据报告。
五、生物药物表征
生物制药是通过现代医学研究手段结合生物生产技术研发生物医药技术产品，主要包括蛋白质、多肽、抗体、疫苗，以及生物诊断试剂等产品。近年来我国的生物医药领域一直保持着稳定发展速度，也一直占据着生物研究的热点。但是生物制品由于生物过程复杂，影响因素众多，使得生物制品在生产过程中可能引入新的杂质，或者造成生物制品本身结构性质变得不均一。这些因素可能削弱生物药物的疗效，甚至造成生物毒性和机体免疫反应等不良结果。所以生物药物在进入临床测试之前必须经过一系列严格检测来确定生物药物是否合规。百泰派克了解生物制药领域开发所面临的挑战，专注于提供完整的生物药物鉴定和分析服务。
百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。
生物药物表征服务内容
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生物药物鉴定服务 |
产品变异性分析 |
生物药物纯度分析 |
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北京百泰派克生物科技有限公司（Beijing Bio-Tech Pack Technology Company Ltd. 简称BTP）从事以生物质谱为依托的生物药物表征，大分子物质（包括蛋白质、多肽、代谢物）质谱分析以及小分子物质检测服务。
1、公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；
2、获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；
3、业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；
4、7大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；
5、服务3000+企业，10000+客户的选择；
6、致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!
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