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文章导读
• 单一蛋白质样品的分离、纯化？
• 单一蛋白质的质谱鉴定？
• 蛋白质混合物质谱鉴定方法？
对于单一蛋白的常用鉴定方法，大家肯定立马想到免疫印迹法（Western Blot）。Western Blot是通过抗体和目标分子的特异性结合从而对目标蛋白进行鉴定，但是这种方法是适用于对已知蛋白进行鉴定，并且必须借助抗体，所以不适用于对未知或者没有相应抗体的蛋白进行分析。那么小伙伴们可能要问了，如果自己要研究的蛋白质是未知的或者目前没有可用抗体怎么办呢？在这种情况下，就可以借助质谱鉴定技术来对蛋白质进行鉴定了。在这期中小编就给大家整理了蛋白质鉴定的相关知识，希望对于蛋白质鉴定一直有困惑的同学能有帮助。
一、单一蛋白质分离纯化
提到单一蛋白样品，顾名思义在这类蛋白样品应该已经经过了一定的蛋白纯化步骤，获得了相对单一的蛋白。通常通过细胞裂解或者体外合成的蛋白质都包含其他的杂蛋白，因此需要将目的蛋白与杂蛋白区分开，常用的蛋白分离纯化方法便是电泳分离。一维电泳分离利用蛋白质大小不同的特性，能够很好的将不同分子量的蛋白进行区分，另外，再次基础之上二维电泳能够进一步将不同带点量的蛋白分子进行区分。
1-. 一维电泳
目前普遍采用的一维电泳为垂直板聚乙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE胶），其原理是不同浓度的乙烯酰胺在聚合后会产生具有一定孔径大小的凝胶，接着在缓冲液中加入SDS表面活性剂中和蛋白质表面的电荷，当变性的蛋白质混合样品通过凝胶空隙的时候，不同分子量大小的蛋白质在凝胶中迁移的速度不同因而被分离开来。一维电泳能够分离对大多数蛋白和蛋白质复合物进行初步分离。
图1. 蛋白质一维电泳分离
2. 二维电泳
二维电泳，也称为双向电泳，是在一维电泳的基础上加入了横向的等电聚焦分离，而其纵向的分离与一维SDS分离方法完全一样。二维电泳shǒu先利用蛋白等电点不同的特性，对蛋白进行初步分离，接着再根据蛋白质分子量不同，再进一步对等电点相同或相近的蛋白质进行二维分离，进一步提升蛋白质分离效率。二维电泳的蛋白分辨率相比一维电泳已经大幅度提升，经过二维电泳分离后大部分蛋白质都能够被分离为含有单一的蛋白质蛋白胶点。
图2. 蛋白质二维电泳分离
二、单一蛋白质鉴定
目前对纯度较高，或单一蛋白质的鉴定的方法有蛋白质指纹谱鉴定（PMF）和MS/MS串联质谱鉴定法。这两种方法都是先将蛋白质酶切成多肽片段，再利用质谱仪对肽段分析，达到对蛋白质鉴定的目的。而两种方法的不同之处就在于PMF法只使用一级质谱对蛋白肽段进行检测，而MS/MS不仅经过一级质谱检测，并且在此基础上选取特定肽段进行肽段破碎，对肽段的序列进行测定。因此MS/MS比PMF的鉴定准确度更高，与数据库比对的可靠性更高，但分析起来的也更为复杂。
1-. 蛋白质指纹谱鉴定（PMF）
由于蛋白质序列的不同，因此不同的蛋白质在同一种消化酶的作用下酶切产生的多肽片段大小质量是特异的。蛋白质指纹谱鉴定法正是利用了每种蛋白酶切产生的太片段不同的特性，对纯化的蛋白质进行酶切处理，再对酶切产生的肽片段的质量进行分析，即可获得蛋白质的肽质量谱图。再将肽谱图与数据库中蛋白质理论肽谱图进行比对，进而可获知蛋白质的身份信息。
2. MS/MS串联质谱法
串联质谱（MS/MS）检测蛋白的原理是先使用一级质谱检测肽段的质量信息，再选取峰值高的肽段进行破碎，分析获得二级质谱。用检索软件选择相应的数据库对质谱数据进行分析，同时以打分的形式评判鉴定结果，当打分大于某个阈值时，即判定质谱鉴定成功，反之则鉴定失败。
三、蛋白混合物鉴定
虽然目前有多种蛋白质分离纯化的方法，但在很多时候分离效率不够高，导致分离后的蛋白可能还是含有多个蛋白。另外，对于丰度较低的蛋白质可能在分离过程中造成进一步损失而无法被鉴定到，因此需要直接对这一类蛋白质不经过分离处理直接进行分析。目前适用于对混合蛋白进行分析的方法有LC-MS/MS色谱质谱串联分析法。与PMF法和MS/MS法相比，LC-MS/MS在质谱分析前加了液相色谱的分离，使得蛋白分析精度更高，对肽段序列测定几乎可以的达到100％的准确度。因此，与单个蛋白质胶带的鉴定相比，这项服务的可以鉴定的蛋白数量也更多。LC-MS/MS可以用于鉴定200个蛋白质左右的蛋白混合物样品，包括免疫沉淀样品，Pull-down样品等。
图3. 三种蛋白质鉴定法比对
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基于生物化学、分子生物学、色谱的检测分析平台：该平台配备了Agilent 2100 生物分析仪、 ProteinSimple凝胶成像系统、高效液相色谱系统，为蛋白质组学、代谢组学分析保驾护航，包括样品制备、分离纯化、分子量测量、杂质表征表达研究等；
基于质谱技术的蛋白质组学分析平台、代谢组学分析平台、蛋白测序平台：该平台配备了超高效液相色谱质谱联用，Orbitrap Fusion Lumos Tribri，Thermo Scientific Exploris以及氢氘交换质谱仪配合机械臂为蛋白质组学、代谢组学和蛋白测序提供了全面的分析手段，包括蛋白质和代谢物的分离、质谱分析、结构分析以及动态信息研究；
生物药物表征平台： 该平台配备了DSC-FTRR差示扫描量热仪与傅立叶变换拉曼光谱仪，氢氘交换质谱仪配备机械臂，为生物药物表征提供了全面的分析手段，包括生物药物的分离、纯化、结构分析和动态信息研究；
基于10x Genomics的单细胞分析平台：该平台能够完成基于10x Genomics单细胞分析平台的检测流程，包括单细胞分选、cDNA合成、文库制备、文库质量检测、PCR扩增以及高通量测序；
基于Fluidigm的单细胞质谱流式检测平台：采用基于Fluidigm Helios流式细胞仪（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于单细胞质谱分析，该平台能够完成包括单细胞捕获、cDNA合成、实时定量PCR分析、目标区域扩增以及质谱流式细胞分析；
基于高精度质谱的免疫多肽组学及免疫学检测平台：基于高精度质谱的免疫多肽组学及免疫学检测平台，能够完成包括多肽分离、纯化、合成、质谱分析、免疫学检测以及分子相互作用研究；
生信云平台：基于生物信息分析方法的生信云平台，能够完成一整套的生物信息学解决方案，包括组学数据的质量分析、差异表达分析、差异表达物GO、KEGG、COG注释分析、聚类分析、相互作用网络等多层次网络和通路的分析。
一、蛋白测序
蛋白测序服务两种主要分析方法
E蛋白测序服务两种主要分析方法：Edman降解（Harvey和Ferrier，2011； Bauer等，1997）和质谱分析（MS）（Sahukar等，2016）。蛋白质测序和鉴定常用质谱法，Edman降解法是表征蛋白质N端重要的方法之一。
百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司Edman降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于Edman降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。
蛋白测序服务流程
蛋白测序服务优势
1 .采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;
2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;
3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;
4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;
5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;
6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。
二、蛋白质组学
蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。确实，那些世界范围内销路好的药物本身是蛋白质或其作用靶点为某种蛋白质分子。因此，蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益。蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。
不同技术的比较
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蛋白质组学服务 |
特点 |
技术要点 |
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Label-free |
非标蛋白质组学 |
无需对样品标记处理； 操作简单； 可大规模分析蛋白质鉴定样品，对样品数量无限制。 |
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iTRAQ/TMT |
体外标记定量蛋白质组学 |
可同时定量分析 2-10 个样品； 体外标记，不受样品类型限制； 可鉴定多达6000个蛋白； 实验稳定度和重复度较高。 |
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SILAC/Dimethyl |
体内标记定量蛋白质组学 |
可对比23 个样品； 体内标记，标记稳定，组间误差小； 需要的样本量较小，仅需几十微克的蛋白。 |
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SWATH |
DIA 全景蛋白质组学 |
全景式、高通量、非质谱依赖的数据采集手段； 数据采集精准高效，线性范围； 检测蛋白丰度跨越 4个数量级； 可分析多达 2000 个蛋白质。 |
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MRM |
绝对定量蛋白质组学 |
基于已知质谱信息来对目标分子进行分析的手段； 检测精准高效，可进行绝对定量分析； 实验结果重现性好，准确度高； 可精准鉴定低丰度蛋白。 |
蛋白质组学服务优势
1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;
2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;
3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;
4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;
5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。
三、单细胞质谱流式技术分析
单细胞质谱流式（Mass Cytometry）技术利用质谱技术对单细胞进行多参数检测，既有传统流式细胞术能够高速分析的特点，又兼并了质谱检测的高分辨能力。能够指定检测蛋白，避免漏掉丰度很低但又很重要的蛋白，且质谱流式技术通量相当高，可以实现大量细胞的检测。
百泰派克生物科技单细胞质谱流式分析方案
百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。
单细胞质谱流式服务优势
①技术先进，填补技术空白
采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。
②分析数量大，成本较低
单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。
③应用前景大
a)流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；
b)将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；
c)可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。
四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现
百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。
基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现分析策略
结果交付
1.所有鉴定的免疫多肽列表，新抗原肽以及肿瘤相关抗原肽列表；
2. 免疫多肽组数据质量分析，如研究案例中的数据报告。
五、生物药物表征
生物制药是通过现代医学研究手段结合生物生产技术研发生物医药技术产品，主要包括蛋白质、多肽、抗体、疫苗，以及生物诊断试剂等产品。近年来我国的生物医药领域一直保持着稳定发展速度，也一直占据着生物研究的热点。但是生物制品由于生物过程复杂，影响因素众多，使得生物制品在生产过程中可能引入新的杂质，或者造成生物制品本身结构性质变得不均一。这些因素可能削弱生物药物的疗效，甚至造成生物毒性和机体免疫反应等不良结果。所以生物药物在进入临床测试之前必须经过一系列严格检测来确定生物药物是否合规。百泰派克了解生物制药领域开发所面临的挑战，专注于提供完整的生物药物鉴定和分析服务。
百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。
生物药物表征服务内容
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生物药物鉴定服务 |
产品变异性分析 |
生物药物纯度分析 |
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北京百泰派克生物科技有限公司（Beijing Bio-Tech Pack Technology Company Ltd. 简称BTP）从事以生物质谱为依托的生物药物表征，大分子物质（包括蛋白质、多肽、代谢物）质谱分析以及小分子物质检测服务。
1、公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；
2、获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；
3、业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；
4、7大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；
5、服务3000+企业，10000+客户的选择；
6、致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!
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