染料法嗜血支原体通用实时定量PCR试剂盒

染料法嗜血支原体通用实时定量PCR试剂盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Universal Hemoplasma

货号：Mqs-hae-20 规格：20个反应

货号：Mqs-hae-50 规格：50个反应

货号：Mqs-hae-100 规格：100个反应

储存：-20度，避光保存，有效期一年。避免反复冻融。

试剂盒特点：

1， 可作为嗜血支原体通用试剂盒使用，可检测绝大部分目前已知的嗜血支原体。

2， 使用热启动的Taq酶，可抑制非特异性扩增，降低背景荧光。

3， 带有阳性对照样品（组分C），可用于检验试剂盒有效性，以及验证待测样品中是否含有PCR抑制剂。

4， 带有ROX参比染料，帮助校正加样误差和管间差异。

5， 带有UDG酶和dUTP，可降低残留DNA的污染。

6， 本试剂盒灵敏度高，可检出反应液中最少达1-10个基因组。

嗜血支原体（Hemotropic mycoplasmas，或hemoplasmas）寄生于多种哺乳动物血液中，附着于红细胞表面，无细胞壁，具多形性，可通过血液传播。嗜血支原体曾被命名为血巴尔通体（Haemobartonella）和 附红细胞体（Eperythrozoon），分类为立克次氏体属，现已重新归类为支原体属。临床上嗜血支原体可引发溶血性贫血症，其他症状还包括：厌食症、昏睡症、脱水、体重减轻、突然死亡等，有时表现为急性发作，也有很多动物感染后症状轻微或无症状。不同种动物感染的嗜血支原体有遗传相似性，提示有跨物种传播的可能性。目前已在猫、狗、猪、牛、羊、驼、鼠等动物中发现嗜血支原体，很多动物的血液支原体感染仍为未知状态。

嗜血支原体尚不能体外培养，一般采用PCR法在血液或组织样本中检测。常规PCR方法较为繁琐，耗时较长，较易产生非特异性扩增；探针法实时定量PCR具有更强的特异性，较少受到残留DNA的污染，较难识别未知物种；SYBR法实时定量PCR可兼具二者的优点，通过熔解曲线来区分不同的PCR产物，提高检测的特异性，相较探针法，又可在一定程度上识别未知物种。

本试剂盒采用SYBR染料法，根据嗜血支原体的16S rRNA基因序列，设计通用引物，可识别寄生于常见哺乳动物（如：猫、犬、猪、牛、羊、鼠等）的所有已知嗜血支原体。通过BLAST验证，本试剂盒与非嗜血支原体的其他物种无交叉反应，个别物种可能产生的非特异信号可通过Tm值轻易排除。使用本试剂盒对320个猫血样进行检测，获得139个阳性。对扩增产物进行测序，证实为嗜血支原体特异性扩增，其中包括猫的全部三种嗜血支原体。

本试剂盒可识别的嗜血支原体包括：Mycoplasma haemofelis、Candidatus Mycoplasma haemominutum、Candidatus Mycoplasma turicensis、Mycoplasma haemocanis、Candidatus Mycoplasma haematoparvum、Mycoplasma suis、Mycoplasma wenyonii、Candidatus Mycoplasma haemobos、Mycoplasma ovis、Mycoplasma haemomuris、Mycoplasma coccoides、Candidatus Mycoplasma haemolamae、Mycoplasma erythrodidelphis、Candidatus Mycoplasma kahanei等。

本试剂盒包含热启动Taq酶、dNTP（以UTP代替了TTP）、引物、阳性对照品、SYBR Green I染料、ROX染料，和用以防止残余DNA污染的UDG（尿嘧啶-N-糖苷酶），用户只需准备好DNA样品即可使用。

热启动Taq酶结合了特异性单克隆抗体的DNA聚合酶，在室温下聚合酶活性被抗体抑制。在PCR循环的变性阶段，抗体受热被去除，聚合酶活性恢复，因此获得“热启动”功能，可减少残余DNA的污染，提高PCR扩增效率、灵敏度和目的片段产量。

SYBR Green I可以与DNA双链的小沟结合，结合后在497nm激发光照射下产生520nm的发射光。未结合双链DNA的SYBR Green I基本不产生荧光。因此可以根据荧光值的大小判断溶液内DNA双链的多寡，用于实时检测PCR反应过程中产物的累积量。初始模板浓度越高，反应循环数越高，则双链DNA含量越高，荧光值也就越高。值得注意的是，SYBR Green I也可以结合非特异性PCR产物以及引物二聚体，此时产生的荧光与目标扩增产物无法区分。为了判断荧光信号是否来自目标扩增产物，可以绘制熔解曲线。通过逐步缓慢升温，使双链DNA解离为单链DNA，同时检测荧光值的变化，绘制曲线，根据荧光值观察DNA解链的温度。

UDG和dUTP可以阻止前次步骤残余DNA的扩增。dUTP可以确保扩增后的DNA中均含有尿嘧啶。UDG可从单链或双链DNA上去除尿嘧啶残基，从而阻止含有尿嘧啶的DNA作为下几轮PCR的模板。在PCR循环开始前的UDG孵育步骤，可以破坏带有尿嘧啶的PCR产物。经过该去除污染步骤后，UDG在正常的PCR循环过程中被高温灭活，对PCR反应没有影响。

ROX不参与PCR反应，在PCR反应过程中荧光没有变化，可以提供一条基线用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参ROX荧光的比值，使定量更准确。ROX染料的激发波长为584nm，发射波长为612nm。用ROX进行校正后可以使实验误差减小十倍左右。

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