细胞转染技术详解

细胞转染技术详解

一、细胞传代

1.   试验准备：200 ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

2.   弃掉培养皿中的培养基，用1 ml的PBS溶液洗涤两次。

3.  用Tip头加入1 ml Trypsin液，消化1分钟（37℃，5%CO₂ ）。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

4.   加入1 ml的含血清培养基终止反应。

5.   用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。

6.  将培养液装入离心管中，1 000 rpm离心5 min。

7.   用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。

8.  将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

9.  将培养皿转入CO₂培养箱中培养，第二天转染。

二、细胞转染

1.  转染试剂的准备

（1）将400 ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

（2）震荡后将试剂放在-20℃保存，使用前还需震荡。

2.   选择合适的混合比例（1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

3.  将混合液在室温放置10-15分钟。

4.  吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

5.  加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

6.  到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。

三、第二次细胞传代

1.   在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

2.   再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10⁵个细胞/35 mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。

3.   在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

4.  转染条件优化可以参考TransFast的使用说明书。