总谷胱甘肽含量测定试剂盒（超微量型）

（C004-96T 酶标板法）

一、测定原理

该测定基于谷胱甘肽（GSH）与5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）(简称：DTNB)反应，产生在412 nm处具有最大吸光值的5'-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB）发色团和氧化谷胱甘肽-TNB加合物（GS-TNB），且在412nm处TNB的形成速率与样品中GSH的浓度成比例。在NADPH存在下，谷胱甘肽还原酶（GR）可将氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原为2GSH，所以测量的谷胱甘肽量代表样品中还原和氧化型谷胱甘肽含量的总和（[T-GSH]=[GSH] + 2×[GSSG]），该含量通常也被认为是样品中总谷胱甘肽含量。

本试剂盒也可测定还原型谷胱甘肽含量。
二、试剂组成
试剂一：液体20mL ×1瓶
试剂二A：液体500μL ×1瓶
试剂二B：液体 500μL ×1瓶
试剂三：液体500μL ×1瓶
试剂四: GSH标准品（粉剂15.7mg × 2管）
稀释液：50mL ×1瓶
三、储存条件及有效期
试剂盒-20℃可避光保存3个月。
四、试剂配制
试剂一工作液：将试剂一用纯水稀释10倍使用；
试剂二工作液：将试剂二B加入到试剂二A中，再加入9mL稀释液，充分混匀，避光冰上保存，现配现用；
试剂三工作液：在试剂二中加入4.5mL稀释液，避光冰上保存，现配现用；
试剂四工作液:将试剂四的一管粉末用100mL纯水溶解，得到浓度为512μmol/L的GSH溶液。取50μL的512μmol/L的GSH溶液，用4.95mL的稀释液稀释得浓度为 5.12μmol/L的GSH溶液。然后进行一系列的二倍稀释，最后得到0，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56，5.12μmol/L的GSH标准溶液浓度。
五、样品准备
样品前处理和保存对获得正确的GSH浓度至关重要，请仔细阅读本部分内容后开始测定操作。不同类型的样本处理方式不同，常见样本处理方法如下：
A)贴壁细胞
选取70-80%融合的细胞（或用户根据实际情况确定），采用冰冷的PBS润洗两次，并采用胰酶消化，消化液采用完全培养基中和胰酶后，1000g，4℃离心5min，去除上清并采用冰冷的PBS润洗沉淀，采用1mL试剂一重悬沉淀，冰上超声破碎细胞，破碎后的细胞可离心去除沉淀，-80℃保存待用或立即进行GSH测定。
B)悬浮细胞
离心收集细胞并采用冰冷的PBS润洗两次，采用1mL试剂一重悬沉淀，冰上超声破碎细胞，破碎后的细胞可离心去除沉淀，-80℃保存待用或立即进行GSH测定。
C)组织样
将组织在适量试剂一中匀浆（通常组织样：试剂一为1：10，w/v），4℃，8000g离心10min，取上清立即进行GSH测定。
D)血浆
抗凝血浆1000g，4℃离心10min，将上层液体移入一新离心管中，加入等体积的试剂一，8000g，4℃离心10min，将上清液移入一新离心管中，立即进行GSH测定。
本试剂盒检测限非常低，一般不需要进行样本浓缩。如样本GSH含量高于标准曲线范围，可用稀释液适当稀释后测定。
六、操作步骤

充分混匀，412nm下快速测定吸光值A0，五分钟后412nm下再次测定吸光值A1
七、计算方法
1、绘制标准曲线
以GSH标准溶液浓度0，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56，5.12μmol/L为横坐标，以酶标仪测得的吸光值差（A1-A0）为纵坐标，利用软件绘制标准曲线，通过软件计算得到一个一元一次方程，一般认为相关系数（R2）大于0.99可用。
实测得标准曲线数据与作图如下：
标准品浓度（μmol/L）    A0             A1               A1-A0
                       0             0.0820     0.1320          0.0500
                       0.08 0.    0890        0.1480          0.0590
                       0.16        0.0930     0.1730          0.0800
                       0.32        0.0980     0.2080          0.1100
                       0.64        0.1040     0.2800          0.1760
                       1.28        0.1200     0.4440          0.3240
                       2.56        0.1450     0.7500          0.6050
                       5.12        0.2140     1.4240          1.2100

2、计算样品浓度
根据标准曲线方程求样品浓度。例如，小明测得某血清数据如下

将A1-A0的数值带入方程y = 0.2270x + 0.0385中的y，求x，得到S1、S2样品的GSH浓度分别为0.5617μmol/L和0.3855μmol/L。
八、注意事项
1. 实验试剂中含有酶，对温度敏感，建议实验尽可能在碎冰上操作。
2. 本方法灵敏度高，可测定低至0.01μmol/L的谷胱甘肽。
推荐标曲范围0.08-5.12μmol/L，但实测在0.01-10.24μmol/L浓度范围内，标曲的相关系数能达到0.998以上。具体标曲范围请用户样品预估浓度进行判断。
3. GSH浓度过高会超出标准曲线范围，务必稀释后进行测定。
4. 反应时间对本测试影响极大，请务必保证样本和标准品A1和A0间间隔时间一致（5min）。如用户酶标仪具备酶促动力学读数功能，建议使用该功能，设置间隔时间为5min自动读数。
5. 加完试剂三后反应会立即开始，请务必迅速进行读数。因此不建议用户一次操作太多样品，推荐一次加样在8孔以内为宜。
6. 本反应进行过程中吸光值线性上升，因此用户如果样本谷胱甘肽浓度过大或者过小，可以自由设定测定A0、A1间的间隔时间，一般推荐设定在2-10min间。但需注意的是，您需要根据时间自行摸索标准曲线的线性范围。
7. 用户也可每30s测定一次吸光值，并依据5min内的测定值（11个点）作出一条直线并求得直线斜率，并根据斜率做出标准曲线和计算样品浓度，该方法较本试剂盒推荐方法（终点法）更为准确，但操作难度和计算量大，供有需求的用户选用。
8. 本说明书给出的标准曲线仅为本公司一次试验测定得到，为方便说明计算方法而给出。由于每次试验加样时间都存在差异，不同批次间的试剂也有一定差别，用户切勿直接套用本说明书给出的标准曲线。
9. 样品前处理方法对测定出的样品中GSH含量影响极大，所有样品均应尽量采用新鲜样品，关于本文未提及的样品处理方法，可通过E-mail向我司咨询。