细胞功能研究

划痕实验检测细胞侵袭、迁移

细胞划痕是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。

细胞划痕内容：

材料：6 孔板（其他的也可以，但感觉6孔比较好，大小适中）、marker笔直尺、20微升枪头（灭菌）、无血清培养基、PBS

步骤：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）

1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。

2．在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。

3．第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。

4．用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。

5．放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。

细胞划痕注意事项：

一般做划痕实验，都是在无血清或者底血清状态下培养的，否则细胞增殖就不能忽略。

按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，这就解决了前后观察时位置不固定的问题。

Transwell检测细胞迁移

一、服务介绍

细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。检测细胞迁移能力的实验包括划痕实验和Transwell实验。

二、实验原理

细胞划痕实验是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。Transwell的基本原理是将transwell小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液。将细胞种在上室内，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

三、实验流程

划痕实验

1. 用marker笔在6孔板背后均匀得划横线；

2. 在孔中加入细胞；

3. 第二天用枪头垂至于背后的横线划痕；

4. 用PBS洗去处划下的细胞，培养不同时间，取样，拍照；

5. 数据处理：每个时间点细胞整体迁移距离=每个时间点距离长度-0时距离；

6. 结果统计分析。

Transwell实验

1. 采用未铺 Matrigel 胶的 Transwell 小室用于实验；

2. 制备细胞悬液；

3. 接种细胞；

4. 检测穿过的细胞数；

5. 结果统计分析。

流式细胞术检测细胞周期

流式检测细胞凋亡

流式细胞术（FlowCytometry，FCM）：

   就是对在高速流动的鞘液包裹下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分选技术。

   重要参数：前向角散射（FSC）：前向角散射光的强度与细胞的大小有关，也就是说，同一个细胞群体，FSC强的，其细胞大一些，而FSC弱的，其细胞小一些。侧向角散射（SSC）：侧向角散射又称90°散射或大角散射。侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。所以，侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。荧光信号（FL）：是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。通过荧光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分开来，也就是我们通常所说的阳性细胞，也可以将阳性细胞中的高FL的细胞与低FL的细胞区分开来，也就是可以把强阳性细胞和弱阳性细胞区分开来。一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3。FL2-W指检测荧光的脉冲宽度，区分单个细胞和双联体细胞FL2-H指脉冲高度，细胞单位面积上的荧光浓度FL2-A指脉冲面积，即细胞荧光总和。

克隆形成检测细胞增殖

一、服务介绍
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。细胞增殖实验--克隆形成。
二、服务流程
1、细胞培养
2、药物处理
3、试剂处理
4、测定吸光度
5、撰写实验报告
三、客户提供
1、培养好的细胞（大于107）以及所需药品。
2、药物作用方式（药物浓度、时间等）。
四、交付内容
实验报告：详细操作步骤、统计分析。

CCK-8检测细胞增殖

一、服务介绍
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。细胞增殖实验--CCK8法。
二、服务流程
1、细胞培养
2、药物处理
3、试剂处理
4、测定吸光度
5、撰写实验报告
三、客户提供
1、培养好的细胞（大于107）以及所需药品。
2、药物作用方式（药物浓度、时间等）。
四、交付内容
实验报告：详细操作步骤、统计分析。

MTT检测细胞增殖

一、服务介绍
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。细胞增殖实验--MTT法。
二、服务流程
1、细胞培养
2、药物处理
3、试剂处理
4、测定吸光度
5、撰写实验报告
三、客户提供
1、培养好的细胞（大于107）以及所需药品。
2、药物作用方式（药物浓度、时间等）。
四、交付内容
实验报告：详细操作步骤、统计分析。