siRNA相关实验

siRNA是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA 是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs)来抑制特定的哺乳动物基因表达。siRNA 是一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的 mRNA，这个过程就是RNA干扰途径（RNA interference pathway）。

siRNA化学合成

尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的一种方法。

主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

最适用于：已经找到最有效的siRNA 的情况下，需要大量siRNA 进行研究

不适用于：筛选siRNA 等长时间的研究，主要原因是价格因素。

siRNA表达载体

多数的siRNA 表达载体依赖3种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹siRNA 在哺乳动物细胞中的表达。这3类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有效的时候。毫无疑问，siRNA 表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。