人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)定量检测试剂盒（ELISA）

【产品名称】

通用名称：人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)定量检测试剂盒（ELISA）

英文名称：Human heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor （HB-EGF) ELISA KIT

 

【包装规格】

48人份/盒，96人份/盒

 

【预期用途】

仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)的浓度。

 

【检验原理】

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)抗体（固相抗体，货号：LT4060111C）的微孔酶标板中，加入人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)标准品（货号：LT4060111J）、待测样本和生物素化的检测抗体（货号：LT4060111K）。经过孵育，样本中存在的 人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)与固相抗体和检测抗体结合。经过洗涤去除未结合的组分，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-HRP)，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。洗涤后，加入显色底物 TMB，避光显色。底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液作用下，最终转化为黄色。在酶标仪上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)的浓度正相关。拟合标准品曲线，可以计算出样本中人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)的浓度。

 

 

【主要组成成分】

主要成分

组分	48T规格	96T规格
标准品	1 vial	2 vial
预包被酶标板	96T	48T
检测抗体	1 vial	1 vial
标准品稀释液	5 ml	5 ml
HRP标记的链霉亲和素	1vial	1vial
10×检测缓冲液	5 ml	5 ml
显色底物 TMB	10 ml	10 ml
终止液	10 ml	10 ml
20×浓缩洗涤液	30mL	30mL
说明书	1份	1份
自封袋	1个	1个
封板膜	3片	3片

 

需要但未提供的材料及耗材

 1、能够检测 450 nm 吸光度的酶标仪，参考波长 570 nm 或 630 nm。

2、精密移液器及一次性吸头

3、蒸馏水或去离子水

4、洗瓶或者自动洗板机

5、37℃水浴锅或恒温箱

6、1L量筒

7、无粉一次性乳胶手套

8、稀释用聚丙烯试管

 

【储存条件及有效期】

  1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。

  2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。

  3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和HRP标记抗体，有效期为28天，其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。

 

【适用仪器】

  半自动的酶标仪，如Thermo MK3，或者国产酶标仪。

 

【样本要求】

  样本类型和采集

以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。

1、细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。

2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。

3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。

 

样本保存和稳定性

样本在2-8℃条件下，可以储存72h，或者在- 20℃储存6个月。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。

 

【试剂准备】

检测前请将所有的试剂、样本恢复至室温。

如果浓缩的试剂出现结晶，37℃温浴，直至结晶全部溶解。

1×洗液

吸取 20×浓缩洗液 50 ml 至 1 L 的量筒，加蒸馏水或去离子水至 1000 ml，轻轻混匀，避免泡沫。

转移至干净瓶内。2 - 25℃贮存，1×洗液可稳定 30 天。

1×检测缓冲液

吸取 10×浓缩检测缓冲液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸馏水或去离子水至 50 ml，轻轻混匀，避免泡沫。

2 - 8℃贮存，1×检测缓冲液可稳定保存 30 天。

检测抗体

稀释前充分混匀。根据标准品和待测样本的数量，用 1×检测缓冲液按 1：100 稀释浓缩的检测抗体。

注意：请在 30 分钟内使用稀释后的检测抗体。

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素

稀释前充分混匀。

根据标准品和待测样本的数量，用 1×检测缓冲液按 1：100 稀释浓缩的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

注意：请在 30 分钟内使用稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

样本稀释

如果样本需要稀释，请用试剂盒提供的 1×检测缓冲液稀释血清/血浆样本，用细胞培养基稀释细胞培养上清

人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)标准品

用蒸馏水或去离子水重溶人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)标准品，重溶体积标注在人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF) 标准品的标签上。轻柔地涡旋震荡，确保充分混匀，重溶后标准品的浓度为 1000 pg/ml。重溶后静置 10 - 30 分钟。稀释前充分混匀。

请使用聚丙烯管进行标准品稀释。

 

血清/血浆样本标准曲线的制作：

取 200μl 浓缩的人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)标准品，加入 200 μl 标准品稀释液，作为标准曲线的最高浓度 (500 pg/ml)。在每一个试管中加入200 μl 标准品稀释液。使用高浓度标准品做 1：1 系列稀释。每次移液时，请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度。

细胞培养上清样本标准曲线的制作：

取200μl浓缩的人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)标准品，加入 200 μl 细胞培养基，作为标准曲线的最高浓度 (500 pg/ml)。在每一个试管中加入 200 μl 细胞培养基。使用高浓度标准品做 1：1 系列稀释。每次移液时，确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零浓度。

 

 

 

 

1000 pg/ml     

 

【操作程序】

1、所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品按前面试剂准备中描述的方法配置好，并建议做复孔。

2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。

3.加入 350 μl 1×洗液静置浸泡25 秒。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后， 在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。

4.每孔加入 50 μl 1×检测缓冲液。

5.复孔加入 50 μl 2 倍倍比稀释的标准品，空白孔复孔加入 50 μl 标准品稀释液。样本孔加入 50 μl样本。

6.每孔加入 50 μl 稀释的检测抗体。保证步骤 4、5、6 连续加样，不要间断。加样过程在 10 分钟内完成。

7.使用封板膜封板。300 转/分钟振荡，室温孵育 2 小时。

8.弃掉液体，每孔加入 350 μl 洗液洗板，洗涤 5 次。每次洗板，在吸水纸上拍干。为获得理想的实验性能，必须彻底移除残留液体。

9.每孔加入 100 μl 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

10.使用新的封板膜封板。300 转/分钟振荡，室温孵育 45 分钟。

11.重复步骤 8。

12.每孔加入 100 μl 显色底物 TMB，避光，室温孵育 5 - 30 分钟。

13.每孔加入 100 μl 终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。

14.在 15分钟之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定 450 nm 最大吸收波长和 570 nm 或 630 nm 参考波长下的 OD 值。校准后的 OD 值为 450 nm 的测定值减去 570 nm 或 630 nm 的测定值。仅使用 450 nm 测定会导致 OD 值偏高，并且准确度降低

 

【检验结果的解释】

计算标准品和样本的平均 OD 值，然后减去零浓度标准品的 OD 值。

检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用计算机软件，回归分析确定最佳拟合曲线，创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。

如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度 

 

【检验方法的局限性】

1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。

2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。

3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。

4、使用试剂盒配套的样品稀释液。

5、如果样本值高于标准曲线最高浓度，请用检测缓冲液稀释样本，并重新检测。如果细胞培养上清样本需要较大的稀释倍数，请用细胞培养基进行适度稀释。

6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测前，请排除该因素。

7、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。

 

【产品性能指标】

1、物理性能

试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。

2、剂量反应曲线线性

校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.9900。

3、精密度

批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%。

批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%。

4、灵敏度

最低检出剂量小于3.2pg/ml。

5、回收率

三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次回收率评估，回收率在85%-115%之间。

6、特异性

本试剂盒识别天然和重组人肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF)，与结构类似物无交叉。

  稳定性

 

    2℃-8℃保存，有效期6个月。