高通量测序服务

基因组研究服务

外显子组测序

全外显子组（ Exome）是指基因组中全部外显子区域的总和，人类的外显子组约占基因组的 1%~2%，包含了蛋白质合成的重要信息，是基因行使功能最直接的体现。绝大部分疾病或性状相关的变异位于外显子区域，与全基因组重测序相比，全外显子组测序仅针对外显子区域内部和边界区域的 DNA进行测序，覆盖度更深，数据准确性更高，可更加经济、高效地发现与疾病或表型相关的个体遗传变异及罕见突变。人全外显子组测序技术已逐步应用到单基因致病基因和复杂疾病易感基因研究中。
1、实验流程


2、外显子组捕获芯片
Roche NimbleGen外显子组捕获芯片SeqCap EZ Exome产品捕获区域达64 Mb，。用于探针设计的数据库涵盖RefSeq, Vega, Gencode, Ensembl, CCDS和miRbase，可更全面的覆盖编码区序列，捕获效率更高，可更为经济有效的发现更多的编码区序列变异。Nimblegen外显子组捕获产品支持多个样品混合进行捕获实验。

3、数据分析
数据产量统计分析
测序深度分析
覆盖度均一性分析
参考序列 mapping
SNPs和InDels检测
基因注释分析

转录组研究服务

circRNA 是通过特殊的选择性剪切产生封闭环状结构的非编码RNA。 circRNA不受RNA外切酶的影响，比线性RNA表达更稳定。研究表明，某些特殊的 circRNA 分子富含 miRNA结合位点，在细胞中起到miRNA sponges的作用，进而解除 miRNA 对其靶基因的抑制作用。ciRS-7(CDR1a)包含 63 个保守的 miR-7结合位点，该 circRNA 在细胞中能够有效吸附miR-7。而miR-7 作为关键调节因子广泛参与癌症途径，如抑制在乳腺癌、胶质瘤等癌症中表达显著上调的Pak1的表达；miR-7 也能通过结合α-synuclein抑制其表达。这些研究暗示ciRS-7 通过ceRNA 机制调节miR-7的功能，是神经系统疾病和癌症治疗的潜在靶点。

图1 cirRNA转录过程 图2 ciRs-7作用机制
目前对circular RNA的研究还不多，特别是对这类RNA的生物学功能研究还有待挖掘。 通过高通量测序技术寻找反向剪接的reads，即back-splicing reads，可以检测样本中circRNA表达及其发现样本中新的circRNA。
图3 cirRNA测序实验流程
数据分析：
1、基础分析
测序数据评估及预处理
基因组比对
circRNA预测
circRNA注释
circRNA表达定量
circRNA差异表达分析
2、高级分析
circRNA关联基因的GO富集分析
circRNA关联基因的KEGG富集分析
circRNA-miRNA靶向预测
circRNA-miRNA-mRNA ceRNA分析

长链非编码RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度大于200 nt且不编码蛋白质的RNAs（不含rRNA），广泛存在于各种生物体内。lncRNAs参与表观遗传、转录以及转录后等多水平的调控过程，在生命活动中具有重要作用。本公司lncRNA测序服务使用高通量测序技术结合先进的生物信息学分析，一次性获得样本中几乎全部的lncRNAs信息，为您全面、深入地研究lncRNAs的功能提供了全新的工具。
一、实验流程

1. 样品提取总RNA后，去除rRNA。
2. RNA片断化。
3. 以短片段为模板，用六碱基随机引物反转录合成双链cDNA。
4. 经纯化、末端修复、加碱基A、加测序接头的步骤，根据测序长度和是否做对读测序，确定琼脂糖凝胶电泳回收片段的大小，并进行PCR扩增，完成测序文库的制备。
5. 构建好的文库经cBot扩增，用Illumina Hiseq2500进行对读测序。
二、数据分析

• 数据产出统计及质量评估
• Reads与参考基因组序列或转录组序列比对
• Reads在基因组上的分布统计
• 转录组表达量的计算
• 基因差异表达分析
• 差异基因生物学通路分析
• 差异基因的GO分析
• 非编码RNA(lncRNA)鉴定（转绿本组装、鉴定已知转录本及预测新转录本）
• 非编码RNA(lncRNA)定量与差异表达分析
• 非编码RNA（lncRNA）功能预
• miRNA测序 基于Illumina HiSeq^TM2000高通量测序技术的小RNA数字化分析，采用边合成边测序的方法，可减少二级结构造成的区域缺失。该技术可以对高质量序列进行序列长度分布的统计及样品间公共序列统计，将筛选后的高质量序列分类注释，从而获得样品中包含的各组分及表达量信息，并对所有小RNA片段进行注释，对新的miRNA则进行靶基因预测。 一、标准信息分析
• 1. 数据产出统计，对原始测序数据去接头污染，去低质量reads；
  2. 18~30 nt 小RNA 测序结果的长度分布；
  3. 样品间的公共序列和特异序列的分析；
  4. 小RNA在选定的参考基因组上的分布；
  5. 小RNA与rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的比对信息；
  6. 小RNA与重复序列的比对信息；
  7. 小RNA与外显子或内含子的比对信息；
  8. 小RNA与miRbase 中指定范围的已知的miRNA的比对；
  9. 按照优先级将小RNA进行分类注释；
  10. 利用Mireap 对没有注释的small RNA进行预测，预测新的miRNA，绘制新的miRNA 的二级结构图；
  11. 已知miRNA的表达谱构建；
  12. 已知miRNA 的家族分析。
• 二、高级信息分析（基于标准分析）
  1. 已知miRNA和novel miRNA的靶基因预测；
  2. 已知miRNA和Novel miRNA靶基因GO注释和KEGG；
  3. 已知miRNA的碱基编辑分析；
  4. 已知miRNA 差异分析和聚类分析；
  5. Novel miRNA 差异分析（2个或2个以上样品）和聚类分析；
  6. 差异miRNA 靶基因预测；
  7. 差异miRNA 靶基因GO 注释和KEGG 通路分析。 转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA 。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。
  8. 技术优势
     • 任意物种的全转录组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因或基因组信息，能够直接对任何物种进行最全面的转录组分析；
     • 覆盖度高：数字化信号，直接测定几乎所有转录本片段的序列；
     • 检测阈值宽：跨越6个数量级的宽检测阈值，从几个到数十万个拷贝精确计数；
     • 分辨率高：可以检测基因家族中相似基因及可变剪接造成的单碱基差异；
     • 检测范围广：从几个到数十万个拷贝精确计数，可同时鉴定及定量正常和稀有的转录本。
     研究内容
     一、无参考基因组序列的转录组
     1. 标准信息分析
     1)    对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理；
     2)    数据产出统计及测序数据的成分和质量评估；
     3)    组装结果分析；
     4)    Unigene功能注释；
     5)    Unigene的GO分类；
     6)    Unigene的COG 分类；
     7)    Unigene代谢通路分析；
     8)    预测编码蛋白框（CDS）；
     9)    Unigene表达差异分析；
     10)   Unigene在样品间的差异GO分类和Pathway富集性分析。
     2. 定制化信息分析
     可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容；
     二、有参考基因组序列的转录组
     1. 标准信息分析
     1)   对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理；
     2)   测序评估；
     3)   基因表达注释；
     4)   基因差异表达分析；
     5)   对基因结构进行优化（仅针对真核生物）；
     6)   鉴定基因的可变剪接（仅针对真核生物）；
     7)   预测新转录本；
     8)   SNP 分析。
     2. 定制化信息分析
     可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容。
     三、链特异性转录组（需提供参考基因序列、参考基因组序列）
     链特异性技术，也称strand-specific RNA sequencing method，是一种能够区分正义链或反义链信息的方法，其对于转录组的功能分析具有十分重要的意义。
     1. 标准信息分析
     1）  正负链信息；
     2）  反义链表达；
     3）  其他（分析内容同常规转录组）。
     2. 定制化信息分析
     可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容。
     四、均一化文库
     分析内容同常规转录组。
     五、非编码RNA测序分析（需提供参考基因序列、参考基因组序列及基因注释结果）
     定制化信息分析: 可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容。
     

表观遗传学研究服务

 基本原理 
    Hi-SNP结合多重PCR技术和高通量测序技术，对需要检测的位点设计特异性引物，在单管内进行多重PCR扩增，不同的样本以不同的Barcode引物区分。混合样本后，在Ion Proton/Ion Torrent平台上，对扩增子进行高通量测序。测序结果使用生物信息学方法，区分不同的样本，最终获得每个位点的SNP信息。高通量测序能一次对几百万条DNA分子进行序列测定，相比其他的SNP检测技术，基于高通量测序的SNP分型具有更准确、更灵敏的特点。

 应用领域 
    本方法适用于很多的遗传学研究领域，例如疾病基因组研究、肿瘤基因组研究、疾病与基因的关联研究、临床分子诊断研究等，在植物基因组研究中，可用于QTL定位及分子育种，非常适合大规模样品的SNP分析。
  
 服务流程 
1、确认实验信息，评估实验可行性
2、样本质控，设计合成引物探针
3、小试、中试，建立实验方案
4、PCR生产，构建高通量测序文库
5、上机测序
6、生物信息学分析，出具实验报告
 
 提供结果 
1、实验报告，包括实验材料、方法、引物等等
2、结果汇总，即基因分型结果（excel形式）
3、统计分析（可选）
 


  样本要求 
1、若分型样品为基因组DNA，要求：DNA浓度≥20ng/ul，体积>20ul。纯度OD 260/OD280 在1.8～2.0之间。
2、若分型样品为血样，样本要求：血液样品，体积大于500ul，需用抗凝剂抗凝，送样过程中请注意保持低温，防止DNA降解。提取DNA将收取DNA提取费。
3、寄送样品时，应在送样包裹中放置足量的冰袋或干冰，以减少在运输过程中因温度变化导致DNA降解的可能。
4、提供SNP位点信息，人类基因组需SNP位点的rs号；其它物种如牛、鸡、鱼等无rs号的，需SNP位点上下游各250bp的确切序列，SNP位点的突变类型，以及位点的上下游25bp内是否存在其它位点。
 
 服务优势 
1、 Hi-SNP单次实验可以得到数百万条序列，能够同时对上千个样本数百个位点进行检测，具有高通量、高灵敏的特点
2、 实验严谨，分区操作，加石蜡油防止气溶胶污染，各个环节保证实验准确性
3、 可以配合LDR技术，方案灵活，性价比高