载体构建、荧光定量等分子生物学综合技术服务

标题：载体构建、荧光定量等分子生物学综合技术服务。



一、载体构建与改造实验技术服务
载体构建与改造概述：
    载体构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。本公司拥有一支经验丰富、优秀刻苦的分子生物学实验技术队伍。可根据您的实验要求为您完成各种载体的构建及改造。

载体构建的基本实验步骤包括
(1)目的DNA片段和载体的制备；
(2)目的DNA片段和载体的连接；
(3)连接产物的转化；
(4)克隆筛选。

技术服务内容：
1、以PCR为基础的各类载体构建，如细菌表达载体、酵母表达载体、杆状病毒表达载体、哺乳动物表达载体；报告基因载体等；
2、基因突变，包括单点突变，多点突变，基因缺失等；
3、载体改造；
4、siRNA表达载体和miRNA表达载体构建。



二、基因过表达慢病毒载体构建
服务简介
    慢病毒载体是指以Ⅰ型人类免疫缺陷型病毒（HIV）HIV-1为基础的载体，通过对病毒基因组的遗传改造，使之携带外源基因和相关病毒元件。改造后的病毒载体去除了毒性基因，因此其包装出的病毒在感染宿主细胞后不会产生新的病毒颗粒，具有很高的安全性。慢病毒表达载体含有质粒转染、病毒包装、稳定整合所需要的基本遗传信息，如HIV-1 的5’LTR 和 3’LTR 以及其他辅助元件，在包装质粒的协助下，可被包装成慢病毒。将外源基因的编码区（CDS）构建至过表达慢病毒载体后，通过直接转染细胞或被包装成慢病毒后感染细胞，可以轻松的表达外源基因，达到研究基因功能的目的。

技术优势
1、用途广泛，既可被用于包装慢病毒，又可作为常规的真核表达载体使用；
2、载体多样，筛选标签种类丰富，便于进行各类实验。

服务内容
1、克隆目的基因的CDS； 
2、目的DNA片段和慢病毒载体的连接；
3、连接产物的转化；
4、克隆筛选；
5、酶切或测序验证。



三、shRNA慢病毒载体构建
服务简介
    shRNAs (RNA-Short hairpin RNAs)：即短发夹RNA，是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子。克隆到载体中的shRNA包括两个短的反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔，组成发夹结构，由polⅢ启动子（如人/鼠源的U6启动子和人H1启动子）控制，随后连上5-6个T作为polⅢ的转录终止子。
我们可以根据靶基因设计shRNA，并合成2条互补的、编码shRNA的DNA单链，退火后连接到慢病毒载体的pol Ⅲ 启动子下游。shRNA慢病毒载体转染细胞后，经由细胞内的RNAi通路处理形成siRNA而最终发挥干扰作用。

技术优势
1、用途广泛，既可被包装产生shRNA慢病毒，又能以质粒形式转染细胞；
2、与化学合成的siRNA相比，shRNA以质粒或病毒形式进入细胞，不易降解，更稳定；
3、载体多样，筛选标签种类丰富。

服务内容
1、设计shRNA序列：根据目的mRNA序列设计3条shRNA序列；
2、模板合成：合成每条编码shRNA的单链DNA模板，退火形成DNA双链。模板链后面连接RNA PolyIII聚合酶转录终止位点，且两端分别设计酶切位点；
3、DNA双链和慢病毒载体的连接；
4、连接产物的转化；
5、测序验证。



四、microRNA过表达慢病毒载体构建
内容简介
    microRNAs（miRNAs）是一类内源性的非编码RNA。编码miRNA的基因组DNA首先转录形成长的初始miRNA（pri-miRNA），后经Drosha核糖核酸酶切割形成发夹结构的、约70-90bp的RNA前体（pre-miRNA）。Pre-miRNA又被Dicer酶剪切成约20-25bp的单链成熟miRNA，进而发挥转录后调控作用。
    miRNA过表达载体构建的主要原理是将pri-miRNA或pre-miRNA序列插入polII启动子下游。其中，pri-miRNA（含侧翼序列）的方式保留了每个miRNA特有的天然双臂结构，效果最好。但对于pri-miRNA序列未知的miRNA，更便捷的方法是体外合成pre-miRNA，并构建到带有mir-30侧翼双臂序列的慢病毒载体中。当miRNA表达载体转入细胞后，可产生茎环结构的pri-miRNA或pre-miRNA，进而在细胞内源的miRNA加工机制下被剪切成成熟的miRNA。

技术优势
1、用途广泛，既可被包装产生miRNA慢病毒，又可以质粒形式直接转染细胞而发挥调控作用。
2、pri-miRNA法保留了miRNA的天然双臂结构，更接近体内真实情况，效果最好。
3、pre-miRNA法可直接合成pre-miRNA，免去了基因调取的流程，易于通量化。

服务内容
1、合成pre-miRNA或调取pri-miRNA;
2、目的序列与miRNA慢病毒载体的连接；
3、连接产物的转化；
4、测序验证；



五、荧光定量PCR（qPCR）
荧光定量PCR概述：
    荧光定量PCR的基本原理就是在PCR扩增过程中，随着PCR循环数的递增，PCR产物不断积累，荧光信号也会相应的增加，这样就可以通过荧光强度的变化来对PCR反应进行实时的监测。本公司根据您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探针法。通过对DNA或RNA的荧光定量PCR监测, 实现基因的相对定量、绝对定量和定性分析。

与RT-PCR相比，荧光定量PCR具有以下技术优势：
 1、实时监测：通过扩增曲线能够实时监测PCR产物的积累。
 2、特异性强：实验完成后，溶解曲线的分析可以验证扩增产物的特异性，降低假阳性。
 3、精确定量：利用扩增进入指数增长期的CT值来定量测定起始模板量，从而实现了极为精确的核酸定量检测。

技术服务内容
1、RNA抽提与定量；
2、引物设计及荧光定量PCR、数据分析；
3、技术服务实验报告提交。



六、定点突变
    定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、突变等。
    定点突变常用于探索调控区（如启动子等）的关键位点，以及研究蛋白质结构与功能之间的关系。

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