病毒转染 腺病毒包装 慢病毒包装

1腺病毒包装:

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应用：

目的基因导入细胞/动物过表达研的究

目的基因导入细胞/动物RNAi干扰沉默的研究

microRNA导入细胞/动物过表达的研究

microRNA导入细胞/动物干扰敲减的研究

实验原理

腺病毒是直径约80-120 nm的无包膜的线性双链DNA病毒，可迅速感染分裂和非分裂期细胞，与细胞表面受体结合后通过内吞作用进入细胞，在细胞核孔附近聚集，并在感染后2h将腺病毒的DNA释放到细胞核中并开始蛋白表达。通过对野生腺病毒进行改造，保留包装信号序列，去除病毒蛋白的编码序列，不仅增加外源基因的装载容量，而且降低细胞毒性和机体免疫反应，从而获得安全性更高的基因导入系统。

腺病毒包装系统的特点：不整合到宿主细胞基因组，无插入致突变性；可进行有效扩增，获得高滴度高纯度的腺病毒。

2慢病毒包装：

应用：
目的基因导入细胞/动物过表达研的究
目的基因导入细胞/动物RNAi干扰沉默的研究
目的基因导入细胞的稳转细胞系构建
microRNA导入细胞/动物过表达的研究
microRNA导入细胞/动物干扰敲减的研究

实验原理

慢病毒属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期，其中最为人所知的是人类免疫缺陷病毒（HIV-1）。HIV-1直径约120nm，含两条正链RNA，可有效的进入细胞核中，对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率。对以HIV-1为基础进行的慢病毒载体的改造，主要是去除致病基因减少辅助质粒与载体质粒的同源性，最终体现在滴度、生物安全性和外源基因表达效率上的提高，见结构示意图。

慢病毒包装系统特点：可通过顺式作用元件将携带的基因运送到细胞核，将要表达的基因序列整合到细胞基因组中，后续可以通过筛选稳转株获得持续稳定的高表达。

实验流程

3 AAV病毒包装

腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒，目前因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。构建重组AAV(rAAV)涉及到用一个目的基因替换病毒基因组的大部分，然后将这个重组基因组包装到一个有感染性的病毒颗粒里。

 腺相关病毒（AAV）载体

1.广泛用于体内实验研究（定点注射与整体注射）

2.表达稳定高效；非整合，转基因安全性高

3.CMV, EF1a, CAG，GBG, Syn 等启动子可选

4.EGFP、mCherry等荧光蛋白可选

 腺相关病毒（AAV）干扰载体

1.广泛用于体内实验研究（定点注射与整体注射）

2.表达稳定高效；非整合，转基因安全性高

3.构建快捷，序列保证准确

4.标记基因可采用EF1a或GBG启动子表达，稳定高效

腺相关病毒包装与纯化

5.腺相关病毒包装采用三质粒系统进行包装，共转染后通过对细胞裂解物进行密度梯度离心纯化和收集病毒。

腺相关病毒滴度检测

腺相关病毒感染细胞

1.检测方法：定量PCR检测病毒基因组中的外源DNA拷贝数

2.对于特定细胞有较高的感染率，如心肌和血管内皮细胞

3.实验原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA

4.感染温和，表达稳定长效

腺相关病毒定位注射

5.感染范围广，可以用于神经系统、眼睛、心肌、肝脏、肌肉和肺部定位注射或定向给药

6.滴度高，颗粒小，扩散能力强

7.表达稳定，可持续半年以上

8.外源基因定向重组，免疫原性低，极少发生非特异反应和免疫抑制，适合于进行基因治疗研究

rAAV定位注射脑皮层区域进行基因沉默

Nature medicine, 2013, 19(6): 773-777.

中枢神经AAV注射

rAAV定位注射纹状体进行基因沉默

PloS one, 2013, 8(6): e64637.

立体定位注射 12 周龄SD 雄性大鼠实验前麻醉。注射时， 将27 号针头用26 号内径的塑料管和10μl 汉米尔顿注射器（由微量注射泵推动）连接在一起，每分钟注入病毒0.2μl，每次3μl。定位海马的坐标是前囟后3.6mm，侧向2.0mm，背向2.8mm。每当针头定位后或是准备拔出前都停留1min。

视网膜下AAV 注射

小鼠用3%异氟醚麻醉，用30 号注射针在接近晶状体的巩膜上切开一个小口，通过这个小孔，用5μl 汉密尔顿注射器（连接微量进样装置）将2μl AAV 病毒缓慢（20-30s内）注入视网膜下。动物选择P21以后的小鼠。从病毒注射到后期实验中间至少休息3个星期。需要进行行为学实验的，两只眼睛都要感染相同的病毒。

整体注射

整体注射是最接近临床治疗方式的实验方法。一般地，利用病毒进行整体注射主要通过胚胎注射、肌肉注射和静脉注射等方式。实验研究发现，对于大部分病毒而言，在动物的肝脏、肾脏和胰脏积累较多；或者通过缺血再灌注等方式，也可以实现心脏的病毒感染。而rAAV病毒作为一种细小病毒，颗粒小，免疫原性低，已经广泛用于整体实验并获得了积极的效果，成为整体实验研究中日趋突出的病毒工具。

病毒的整体注射对病毒滴度和体积有较为严格的要求，滴度低的病毒会造成感染和表达减弱甚至根本无法感染；滴度过高或杂质过多的病毒会引起免疫反应造成动物死亡。作为免疫原性最低的AAV病毒载体，其在不同组织中的感染活性与血清型有着密切关系。其滴度范围一般在1012v.g./ml以上。一般认为，为了增强在某一组织中的表达，采用组织特异启动子可以达到更好的效果。

rAAV整体注射肝脏感染效果