腺病毒构建与包装技术服务

  腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳（capsid）呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六联体（hexon）、12个五联体（penton）及12根纤毛（fiber），除此之外还有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区（knob）。五联体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。腺病毒的基因组以线性的双链DNA形式存在，由蛋白VII和一种称为mu的小蛋白紧密地环绕在其周围，起到类组蛋白样的作用。另一种蛋白V将这种DNA-蛋白复合物连接起来，并通过蛋白VI与病毒衣壳连接在一起。在两条链的5′端各以共价键结合着一个被称为DNA末端蛋白（pTP）复合物（DNA-TPC）的特化的结构，与腺病毒复制密切相关。腺病毒基因组的两端各有一段100bp的反向末端重复序列（ITR），是复制的起始位点。在左端ITR的3′侧有一段长约300bp的包装信号（ψ）介导腺病毒基因组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的ITR和包装信号（ψ）的约0.5kb的序列是顺式作用元件，也就是说必须由腺病毒载体自身携带，而其他的30余种蛋白都可以通过辅助病毒（或细胞）反式补足。

根据Journal of Gene Medicine的统计，截至2006年，在全球1192项基因治疗临床试验方案中，有305项(26％)使用腺病毒载体，首次超过反转录病毒，居第一位。腺病毒易于制备、纯化和浓缩，且病毒滴度可高达10^12PFU/ml，比逆转录病毒高出100,000倍以上。所以，它介导的基因治疗常采用in vivo的方式进行，是目前基因治疗临床试验中应用最多的一种载体。 在过去的2014年，使用腺病毒载体研究的客户越来越多，慢慢成为一种常规的科研手段。

红土生物组建了专业的技术团队开展重组腺病毒相关技术服务，提供Ad2和Ad5两种血清型重组腺病毒载体构建、扩增、纯化以及相应的技术咨询服务，如腺病毒载体的细胞感染方法，腺病毒载体相关的动物实验操作等。

★1、腺病毒穿梭载体的构建

客户提供含有目的基因的原始质粒，红土生物将该目的基因克隆至穿梭载体。

★2、腺病毒载体的同源重组

利用重组技术将目的基因的表达框从穿梭载体转移到腺病毒载体，由于腺病毒骨架质粒与穿梭质粒分别有两段序列相同的同源臂，同源重组后，挑取重组子进行酶切鉴定，挑选酶切鉴定正确的克隆，进行下一步腺病毒载体的包装。

★3、腺病毒载体的包装与扩增

将筛选到的重组腺病毒载体运用脂质体法转染到293细胞中进行包装，将包装好的病毒超速离心收集，经过纯化后提供给客户至少达到1×10^12vp以上的病毒量，可直接用于干细胞和动物实验（根据客户需要，不同量有价格差异）

 红土生物使用的重组腺病毒系统，除了克隆阳性率高、包装稳定、出毒迅速、滴度高外，最大特点在于加入了调控基因，可以根据实验需要人为调控目的基因的表达程度，另一方面，红土生物使用的重组腺病毒系统，几乎可以在腺病毒容量内转入任何目的基因，具有同类产品不可比拟的优势。