甲基化检测

      DNA 甲基化在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下的CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶，是最早发现的修饰途径之一。原核生物中甲基化 多发生在CCA/TGG和GATC序列；真核生物中DNA甲基化一般发生在CpG位点上；哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶,植物甲基化发生 在CpG和CpNpG。甲基化会使胞嘧啶转为5-甲基胞嘧啶,CpG位点在基因组是不常见的，主要密集于接近基因启动子的位置,统称为CpG岛。CpG位 点的甲基化可以对基因表现有重要的影响。

      DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表 达。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列的前提下实现对基因表达的调控。

      目前，甲基化检测的主要研究方法是基于亚硫酸氢盐处理的甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)和亚硫酸氢盐测序(Bisulfite sequencing PCR,BSP)。 除此之外，还有高分辨率熔解曲线法(High Reso- lution Melting,HRM)和焦磷酸测序法。
     
      MSP
      甲 基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有 未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物,如果用针 对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之,说明被检测的位点不存在甲基化。
       

该方法具有以下优点:       1、检测灵敏度高,样品消耗少,仅需1μg的gDNA；       2、快速、简单,省时；       3、可结合Real-time PCR技术(Taqman 探针) 对样品中检测位点甲基化水平进行定量。

      BSP
      亚 硫酸盐测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化 的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿 嘧啶全部转化为胸腺嘧啶。最后对PCR产物进行测序，可以判断CpG位点是否发生甲基化。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方 法称为BSP-克隆测序法。

该方法具有以下优点:       1、特异性高：能提供高特异性分析结果，是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；       2、灵敏度高：可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的gDNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点。

HRM       高分辨率熔解曲线法，是近年来兴起的甲基化检测的新方法。 在非CpG岛位置设计 一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化,用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞 嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变,样品中的GC含量发生改变,从而导致熔解温度的变化。

      焦磷酸测序法
      焦 磷酸测序(Pyrosequencing)技术是由4种酶(DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfu- rytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase))催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。每 一轮测序反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3'末端,同时释 放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的dNTP和释放的PPi是等量的。CpG甲基化焦磷酸测序检测法基于引物延伸的Pyrosequencing技 术，通过将链合成过程中释放出的焦磷酸(PPi)转化成光信号来监测链的合成过程。通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行 定量分析方法。