热点实验：免疫沉淀实验案例介绍

[关闭窗口]

电联
起订量：
供货总量：
发布时间：2015-07-09产品供应时间：长期有效

北京嘉美臻元生物技术有限公司 进入店铺

所在地：中国

企业类型：企业单位

公司地址：北京市朝阳区北苑路旭辉奥都7-2404

联系人：欧阳臻 (先生)
手机：18210860622

在线联系：

传真：未填写

告诉好友

违规举报

分享拿好礼：

企业信息

北京嘉美臻元生物技术有限公司
[VIP会员第10年] 信用度:8级
会员级别：VIP会员第10年信用度：8级
店铺等级：
认证类型：
身份认证：通过认证 [诚信档案]
联系人：欧阳臻(先生)
已缴纳 0.00 元保证金
在线联系：
会员状态：[当前离线] [加为商友] [发送信件]
注册资金：100人民币
企业规模：100-499人
企业类型：企业单位
经营模式：服务商
经营范围：实验技术服务平台；生物技术检测服务，测试加工服务；生物领域技术研发，技术咨询，技术转化和技术推广服务；实验室试剂、耗材、器材销售，代理进出口。

相似产品推荐

产品详情
联系方式

品牌：
所属分类：技术服务 » 生物技术服务 » 实验技术服务
计量单位：
最小起订量：0
供货总量：0
发货期限：自买家付款之日起3天内发货

小鼠XX细胞药物干预后两种蛋白的磷酸化酪氨酸水平检测

实验分组：小鼠XX细胞，按下面分组进行药物干预培养，并收集细胞进行免疫沉淀实验。

1	正常对照组
2	高糖组
3	高糖+E药物
4	高糖+A药物(25μM)
5	高糖+A药物(50μM)
6	高糖+A药物(100μM)
7	高糖+A药物(100μM)+B药物（1mM）
8	高糖+C药物(25μM)
9	高糖+C药物(50μM)
10	高糖+C药物(100μM)
11	高糖+C药物(100μM)+B药物（1mM）
12	高糖+D药物(25μM)
13	高糖+D药物(50μM)
14	高糖+D药物(100μM)
15	高糖+D药物(100μM)+B药物（1mM）

免疫沉淀过程

实验试剂：A抗体（santa cruz，IP浓度 1:100）；B抗体（santa cruz，IP浓度 1:100）；Protein A+G Agarose（嘉美生物）
蛋白样品的准备：1).对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用嘉美生物Western及IP细胞裂解液或各种RIPA裂解液等进行细胞的裂解。 2).对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。 3).对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。注意事项：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
去除非特异性结合：1).取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。2).2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。注意事项：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
免疫沉淀：采用A蛋白抗体，B蛋白抗体沉淀蛋白。1）.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。 2）.再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。3）.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。4）.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。 5）.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。 6）.100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品可测定浓度或者用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。

Western blot检测

实验试剂：Phosphotyrosine抗体( Millipore, #05-321, 1:500)；Goat Anti Mouse IgG+A+M(H+L)/HRP(ZYMED, #62-64201,1:40,000-100,000)
实验设备：① 电泳电源：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；② 电泳仪及附件：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)；③ 电转仪及附件：Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)；④ NC膜：PIERCE，Catalog#88018；⑤ 滤纸：Whatman,3MM CHR
实验步骤：略
实验结果：目的蛋白检测，取以上沉淀下来蛋白混合液处理后，每孔点样15ul。

注：SDS-PAGE凝胶浓度为12%；阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其（integrated optical density）累积光密度参考值。(例如：1.33E+05=1.33×10⁵)。

Lanes:	Lane 1	Lane 2	Lane 3	Lane 4	Lane 5	Lane 6	Lane 7
Rows	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)
p-A蛋白	19.415	79.179	81.869	64.923	64.544	38.742	76.364
样本NO	1	2	3	4	5	6	7

Lanes:	Lane 1	Lane 2	Lane 3	Lane 4	Lane 5	Lane 6	Lane 7	Lane 8
Rows	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)
p- A蛋白	66.048	38.485	24.444	41.068	50.312	57.092	42.603	94.83
样本NO	8	9	10	11	12	13	14	15

Lanes:	Lane 1	Lane 2	Lane 3	Lane 4	Lane 5	Lane 6	Lane 7
Rows	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)
p- B蛋白	19.37	61.188	56.7	47.383	42.308	16.953	75.589
样本NO	1	2	3	4	5	6	7

Lanes:	Lane 1	Lane 2	Lane 3	Lane 4	Lane 5	Lane 6	Lane 7	Lane 8
Rows	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)
p- B蛋白	70.891	38.042	43.421	29.656	64.184	25.98	41.653	77.76
样本NO	8	9	10	11	12	13	14	15