热点实验：凝胶电泳迁移率（EMSA）实验案例介绍

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所属分类：技术服务 » 生物技术服务 » 实验技术服务
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小鼠XX细胞药物干预及核因子蛋白A凝胶电泳迁移率（EMSA）检测

实验分组：
A组对照组(DMEM 1000ul)
B组 A药物组（DMEM 960ul+A药物40ul ）
C组 A药物+B药物组（DMEM 892.5ul+ A药物40ul+B药物 67.5ul）
D组 B药物组（DMEM 932.5ul+B药物 67.5ul）
注：培养基与B药物，2小时候加A药物，24小时后收集细胞检测。

实验试剂：LightShift Chemiluminescent EMSA Kit(PIERCE,20148)；Chemilumi-Nucleic Acid Detection Kit（PIERCE,89880）；NF-KB p65探针序列；Boitin-N4-CTP（invitrogen,15918-18）；TdT（NEB,M0252L）；Poly(dI.dC) （sigma,P4929）；Hybond-N+ 尼龙膜（Amersham,RPN303B）；6×Loading Buffer (TAKARA)

实验仪器：离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，TG16-W）；电泳电源：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；电泳仪及附件：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)；电转仪及附件：Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170-3930)；

生物素标记探针：
1、按如下顺序加入反应物，温和混匀，切勿涡漩
   超纯水                          25μl
   5×TdT Reaction Buffer         10μl
   探针(1μM)                     5μl
   Biotin-N4-CTP                  5μl
   TdT (2U/μl)                  5μl
   37℃反应30分钟
2、加入2.5μl 0.2M EDTA终止反应
3、加入50μl 酚：氯仿，短暂涡漩，15000g离心2min，保留上层水相，-20℃保存。
4、结合反应前等体积混合两条标记引物，90℃退火引物，并自然冷却至4℃，待用。

抽提核蛋白：
1、2-3×10⁶密度铺60mm细胞培养板，培养约12h
2、移去细胞培养基，PBS洗细胞一次
3、加入1mL Buffer B 于培养板，将细胞刮下收集于1.5mL离心管
4、1000g 离心2min，吸去上清
5、加入160μl Buffer A，重悬沉淀，冰育20min
6、加入含2.5％NP-40的Buffer A，涡漩10s，4℃ 15000g 离心5min
7、吸去上清，加入40μl Buffer C，4℃涡漩25min，4℃ 18000g 离心5min
8、吸取2μl上清采用Bradford法测蛋白质浓度，其余储存于-80℃
蛋白浓度测定如下表：mg/ml

No.	浓度
1	0.354
2	0.295
3	0.314
4	0.282
5	0.300
6	0.361
7	0.294
8	0.310
9	0.344
10	0.256
11	0.275
12	0.257

配置非变性聚丙烯酰胺凝胶:略

EMSA实验步骤：
1、按如下顺序加入反应物，温和混匀（20μl体系）
   ddw                                 ――
   10×binding buffer                  2μl
   Poly(dI.dC)                       1μl
   核蛋白粗提物                       10μg（温和混匀）
   生物素标记的探针（0.1μM）           0.5μl
室温反应20min，加入6×Loading Buffer 4μl，上样10-20μl，100V电泳至溴酚蓝于三分之二处。
2、电转前将尼龙膜浸泡于0.5×TBE至少10min以预冷的0.5×TBE为电转缓冲液100V转胶于尼龙膜上，45min
3、UV BOX下，以贴近膜一面面向紫外光源，以254nm激发光交联15min
4、加入25mLBlocking Buffer，以约70rpm在脱色摇床上封闭30min
5、将SA-HRP以1:30000-50000稀释于12mL Blocking Buffer，脱色摇床70rpm作用20min(洗膜过程全部在脱色摇床上进行, 约100-140prm)
6、Buffer II 25ml, 5min
7、wash buffer 25ml 15min
8、Buffer III 25ml 5min×2次
9、0.1%SDS in 2×SSC, 5min×2次
10、0.1%SDS in 1×SSC, 10min×2次
11、0.1%SDS in 0.5×SSC, 5min×2次
12、将膜于滤纸稍适吸干，加入到以1:20稀释的发光反应液，作用1-5min，将尼龙膜封于保鲜膜中（避免褶皱和气泡的产生），暗室曝光1-5min，检测信号。

实验结果：采用Gel Pro 4.0 软件分析（核因子A band）IOD参考数值
p：probe only. 只加入标记探针未加入核蛋白抽提物。
C: Postive Control : 采用德国MERCK公司, Cat#71183-3，Cat#71377-3，Cat#71518-3试剂盒中Hela control Nuclear Extract