原代细胞培养：原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题

Case：新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养冰检测相关蛋白与基因

一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养：
    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

四、WB检测新生SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A蛋白、B蛋白、FKBP12.6蛋白表达水平
1、实验材料
    PBS、细胞裂解液、PMSF、BCA试剂盒（嘉美生物）、5×蛋白上样缓冲液、脱脂奶粉，CaMK-Ⅱδ一抗（Abbioscience）、B蛋白一抗（Abbioscience）、FKBP12.6一抗（Abbioscience）、β-actin一抗（Abbioscience）和B蛋白一抗 (Millipore)、山羊抗兔-HRP二抗(abcam)、ECL Reagent（嘉美生物）、显影剂、定影剂。
2、实验仪器
    细胞刮、1mL注射器、EP管、移液器、冷冻离心机、摇床、酶标仪、电泳器材、PVDF膜、电转器材、X光片、压片盒。
3、实验方法
   （1）细胞裂解液配制：基础裂解液中加入0.2mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂。
   （2）蛋白样品制备：
        ①弃去六孔板细胞中的培养基。
        ②每孔细胞中加入2mL 4℃预冷的PBS，平放轻轻摇动2min洗涤细胞，然后弃去PBS洗液。重复以上操作。
        ③每孔加入100μL细胞裂解液在冰上对细胞进行裂解，然后用细胞刮将细胞刮下，最后将裂解液移入干净的EP管中。
        ④将EP管中细胞冰上裂解30min，在此期间用1mL 注射器对裂解液进行反复抽吸20次。 
        ⑤裂解完后，于4℃，12000rpm离心20min。然后将上清移入新的1.5mL EP管中，即为所需蛋白样品。
        ⑥每样本取3μL  蛋白提取液转入另外的EP管保存备定量用。向其余蛋白样品中加入其1/4体积的蛋白上样缓冲液，沸水煮5min，最后将其－80℃保存。
   （3）蛋白浓度测定：
         根据嘉美生物BCA试剂盒说明书中步骤进行实验。具体步骤如下：
        ①将0.5μg/μL 蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16ul加到96孔板中，然后将各孔用细胞裂解液补足到20μL。
        ②每样品加2μL 到96孔板的样品孔中，然后将各孔补加18μL 的细胞裂解液。
        ③各孔加人200μL BCA工作液（BCA试剂A: BCA试剂B=50: 1），37℃条件下放置30min。
        ④用酶标仪测定562nm波长处各孔的吸光度。最后根据标准曲线计算蛋白浓度。实验结果见后面结果部分内容。
   （4）SDS-PAGE电泳：
        ①配胶：CaMK-Ⅱδ（1.5mm 10%分离胶, 5%浓缩胶）、A蛋白、B蛋白（1.5mm 5%分离胶，4%浓缩胶）、FKBP12.6（1.5mm 15%分离胶，5%浓缩胶）
        ②上样：取制备好的蛋白样品，使用前沸水煮5min，12000rpm离心2min。各样本之间平衡后，每泳道上样45μL。
        ③电泳：浓缩胶60V，分离胶100V，溴酚蓝移动至玻璃板底端，提示电泳结束，关闭电源。
   （5）转膜：
        ①将PVDF膜放到甲醇中浸泡2min，然后把转膜海绵垫、滤纸、PVDF膜放置于电转液中平衡30min。
        ②将转膜夹打开，在代表负极的黑色面铺上一块湿润的海绵垫，再添加2层湿润的滤纸，将电泳好的SDS-PAGE分离胶小心地铺在滤纸上方，表面再覆盖大小合适的PVDF膜；然后再覆盖两层湿润滤纸，再垫上湿润的海绵垫，最后将转膜夹的红色面与黑色面闭合好，将其放入转膜槽中相应的位置。
        ③转膜CaMK-Ⅱδ（100V，60min）；A蛋白、B蛋白（100V，180min）；FKBP12.6（80V，30min），转膜全过程在冰上进行。
        ④丽春红染色：转膜完成后，将膜从转膜夹中取出，立即投入丽春红染液中染色，大约染色3min 后将膜从丽春红染液中取出，用DDH2O轻轻冲洗膜，注意观察膜上的红色条带，当条带足够清晰后停止水洗，根据蛋白Marker位置适当剪膜，留出目的蛋白所在的范围。最后用DDH2O彻底洗膜，尽可能洗去残留的丽春红染料。
   （6）封闭：室温条件下，5%脱脂奶粉+TBST在摇床上封闭1h。
   （7）一抗杂交：
        CaMK-Ⅱδ（1:500）、A蛋白（1:200）、B蛋白（1:50）、FKBP12.6（1:300）、β-actin（1:1000），4℃孵育过夜。
   （8）洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
   （9）二抗杂交：山羊抗兔-HRP二抗（1:2500），室温孵育1h。
   （10）洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
   （11）显影：
         首先，用滤纸吸去膜上的液体，将膜平放于保鲜膜上，将新鲜配置好的ECL Reagent滴加到膜面上，反应3min后用滤纸在膜的边缘尽量吸去多余的ECL Reagent，然后根据条带的亮度将膜放到压片夹中曝光适当的时间，最后，显影、定影、冲洗胶片及对胶片进行扫描分析。

BCA试剂盒蛋白定量实验结果：
标准品OD值分别为：0.488、0.519、0.559、0.603、0.668、0.759、0.884
LG组、NG组、HG组、HG+U组OD值分别为：0.646、0.677、0.671、0.698
ONOO组、DC-ONOO组、ONOO+U组OD值分别为：0.816、0.703、0.79、0.612

WB实验结果：

嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。