体内磷酸化位点鉴定

体内磷酸化位点鉴定-详情"体内磷酸化的过程就是在激酶的催化作用下，将三磷酸腺苷（ATP）的磷酸根基团转移到蛋白的氨基酸侧链上，ATP随之变为二磷酸腺苷（ADP）。磷酸化修饰可以发生在多种氨基酸残基上，主要集中在肽链中的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基上，这些残基上具有游离的羟基，且本身不带电荷，当磷酸化作用后，蛋白质便具有了电荷，从而使结构发生变化，进一步引起蛋白质活性的变化。体内磷酸化位点鉴定主要通过质谱法进行

无标记磷酸化

无标记磷酸化-详情"蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰（PTM），它动态可逆地调控细胞中几乎任意一个生物学过程。伴随着基于质谱的蛋白质组学技术和磷酸化多肽富集方法以及高通量定量技术的不断发展，磷酸化蛋白组学已经成为目前zuì为成熟的PTM研究方向。无标记磷酸化是利用无标记定量方法对具有磷酸化修饰的蛋白质肽段进行相对定量分析，以下将对两种常用的无标记磷酸化检测技术进行简单概述。传统非标记定量（Label Free Quant

验证蛋白磷酸化

验证蛋白磷酸化-详情"蛋白质磷酸化在许多生物学过程中起着非常重要的作用，包括细胞生长、增殖、泛素介导的蛋白降解等过程。在研究蛋白的磷酸化修饰过程中，shǒu先需要确定哪些候选蛋白被磷酸化修饰了，确定研究哪些目标蛋白，之后需要靶向的针对这些目标蛋白来分析验证蛋白磷酸化。一般可以通过几下几种方法验证蛋白磷酸化，以内源材料/过表达目的蛋白为例：（1）通过标签抗体（或者目的蛋白一抗）进行免疫沉淀（IP）实验，然后

IP-MS打质谱非特异互作的蛋白一般有哪些

IP-MS打质谱非特异互作的蛋白一般有哪些-详情"免疫沉淀（IP）是研究蛋白质相互作用的一种经典技术，而免疫沉淀串联质谱分析（IP-MS）是目前应用zuì广泛的蛋白相互作用研究方法之一。IP-MS的主要原理是基于特异性抗体或其他亲和试剂与靶标蛋白的亲和作用，通过免疫共沉淀（Co-IP）将靶标蛋白与靶标蛋白相互作用的蛋白从复杂的样本中提取出来，进而进行质谱检测以鉴定靶标蛋白的相互作用蛋白。通过IP-MS研究蛋白相互作用以及互作蛋

通过IP所得样本进行蛋白质谱分析

通过IP所得样本进行蛋白质谱分析-详情"一般的质谱技术是不能直接研究蛋白互相作用的，需要和其他技术联用，如通过免疫沉淀（IP）所得样本进行蛋白质谱分析，然后再用质谱法鉴定IP所得样品中的蛋白质。甚至于可以比较不同样本中，这些蛋白的相对丰度并寻找差异蛋白。质谱技术不仅能够验证已知蛋白相互作用，还可以鉴定与目标蛋白发生相互作用的未知蛋白。IP即免疫沉淀，它是用靶蛋白的特异性抗体捕获细胞内的靶蛋白复合物。基于“靶

IP质谱结果分析

IP质谱结果分析-详情"免疫沉淀（IP）是研究蛋白质相互作用的一种经典技术，而免疫沉淀串联质谱分析（IP-MS）是目前应用zuì广泛的蛋白相互作用研究方法之一。在对IP样品进行质谱检测之后，需要进行IP质谱结果分析才能得出zuì终的结论。在目前的IP-MS处理中，常以蛋白的非标记定量信号强度（LFQ intensity）为指标对蛋白质进行定量分析，可通过选择更高的差异蛋白筛选阈值的设定来对实验组与对照组间蛋白定量差异进行分析。在IP-MS

IP后跑胶

IP后跑胶-详情"在获得免疫沉淀（IP）样品之后，由于质谱检测的成本相对较高，需要在IP样品进行质谱检测之前进行IP后跑胶预实验。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分别进行蛋白质印迹（Western blot，WB）及银染或考染预实验,评估该IP样品是否适用于质谱检测。通过SDS-PAGE电泳和银染或考染预实验可评估IP样品蛋白量，WB预实验可评估IP所用抗体的特异性和亲和富集效率。通过加入SDS-PAGE试剂制作SDS-PAGE凝胶板，

IP样品考染

IP样品考染-详情"IP样品考染即将免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）拉下的蛋白样品电泳后进行考马斯亮蓝染色。在获得IP样品之后，质谱检测之前，一般需要将IP样品进行电泳预实验以评估其质量。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及考马斯亮蓝染色（简称考染）预实验可评估IP样品蛋白量，从而评估该IP样品是否适用于质谱检测。若考染结果表明IP样品中蛋白量较高且差异明显，则可将该IP样品进行后续的质谱送样检测

SILAC-IP

SILAC-IP-详情"SILAC（Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture）技术即细胞培养条件下稳定同位素标记技术，采用含有轻、重同位素型必需氨基酸（主要是Lys和Arg）的培养基进行细胞培养，细胞传代若干代后（一般培养5-6代），细胞内蛋白质被同位素稳定标记，将蛋白质等量混合后进行分离和质谱鉴定，根据比较一级质谱图中两个同位素型肽段的面积进行相对定量。免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）技术是基于抗体

SILAC-MS-IP

SILAC-MS-IP-详情"免疫共沉淀（Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，用于确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。Co-IP与质谱（MS）可以对整个蛋白复合物进行富集，进而鉴定这

CO-IP后做质谱实验分组的设计

CO-IP后做质谱实验分组的设计-详情"免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等基质上的特异性抗体对抗原进行小型亲和纯化的一种方法。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种常用的鉴定蛋白-蛋白相互作用的方法，通过使用诱饵蛋白（IP中的抗原，bait protein）特异性抗体间接捕获与其结合的靶蛋白（prey protein）。在免疫沉淀串联质谱（IP-MS）实验过程中，质谱检测环节对于实验组和对照组

体外结合实验与免疫沉淀的区别

体外结合实验与免疫沉淀的区别-详情"蛋白质体外结合实验（即Pull-down实验）和免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是研究蛋白质相互作用的两种方法，两者存在一定区别又可互为验证试验。免疫共沉淀实验（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）与IP实验一样，两者均是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。其原理是：当细胞在非变性条件下裂解时，体内存在的蛋白质利用抗体与抗原之间的亲和性将互作

体外下拉实验和免疫共沉淀结合

体外下拉实验和免疫共沉淀结合-详情"体外下拉实验和免疫共沉淀结合使用可作为验证体内外蛋白质间接或直接相互作用的强有力方法，两者都是利用亲和配体来捕获互作蛋白，也可分开单独作为研究蛋白质相互作用的方法。免疫共沉淀实验，即Co-IP实验，是以抗体与抗原之间的专一性作用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方法, 也是确定2种蛋白在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。这种方法常用于测定2种目的蛋白是否在体内结合；也可用

体内泛素化实验与免疫共沉淀

体内泛素化实验与免疫共沉淀-详情"蛋白质泛素化，或靶蛋白共价结合泛素，在细胞周期的运转中以及细胞内信号转导通路中发挥了至关重要的作用。泛素介导的信号转导的多样性取决于目标蛋白可以通过多种方式被泛素修饰，在一个或多个位点的单泛素化，和通过几种可能键合的多泛素化。每一个泛素分子有七个可能的赖氨酸残基可用于泛素链的延伸；因此多泛素化的功用取决于泛素链延伸中所用的赖氨酸残基。而这是由特异的泛素结合酶或泛素连

细胞膜蛋白co-ip

细胞膜蛋白co-ip-详情"免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。Co-IP是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法，细胞膜蛋白Co-IP可用于验证细胞膜蛋白之间或者膜蛋白与其他蛋白的相互作用。在膜蛋

组织Co-IP

组织Co-IP-详情"免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）使用靶蛋白特异性抗体间接捕获与特定靶蛋白结合的蛋白来鉴定体内相关的蛋白-蛋白相互作用，是研究蛋白互作的经典方法。在组织Co-IP实验过程中，为了保证足够多的蛋白浓度以维持原本存在的蛋白质互作状态，通常需要准备足够多的动物或者组织样品。且Co-IP的实验条件很难一次成功，常需要反复摸索，尤其当蛋白丰度较低、相互作用力不强、使用不易提取蛋白的组织等情况时

蛋白MS

蛋白MS-详情"几十年来，质谱（MS）一直是zuì广泛使用的高通量蛋白分析的“金标准”技术。蛋白MS分析通过将蛋白酶解消化为小分子肽段来进行肽段序列识别，它兼具高扫描速度、高灵敏度和分析复杂混合物的能力，是一种非常适合分析蛋白质的技术。此外，现在有无数基于MS分析的蛋白质组学具有独特的样品制备技术、质量分析器和数据软件的组合。质谱结果的搜库解析是依赖于数据库和统计学计算的，不同搜库引擎的匹配过程和打分模式不尽

无标签LC-MS/MS蛋白质组学分析

无标签LC-MS/MS蛋白质组学分析-详情"随着高效液相分离技术（HPLC）和静电场轨道阱（Orbitrap）质谱技术的发展，液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）成为目前蛋白质组学分析的主要技术。基于LC-MS/MS的蛋白质组学技术取得了重大进展，在灵敏度、选择性、重现性、蛋白质覆盖率和成本效益方面的表现越来越好。基于LC-MS/MS的蛋白质组学技术为量化复杂的蛋白质混合物提供了一种高通量的方法，其量化能力比那些基于免疫亲和力的传统量化方法（

蛋白N端糖基化

蛋白N端糖基化-详情"蛋白糖基化修饰是糖链分子在糖基转移酶的催化作用下与肽链氨基酸侧链活性基团反应生成糖苷键，从而使糖链连接到蛋白质上。蛋白N端糖基化是将含有14个单糖的糖链（Glc-3-Man-9-GlcNAc-2）与蛋白质上天冬酰胺（Asn）的酰胺基团以N-糖苷键的形式共价连接，从而使糖链由磷酸多萜醇载体上转移至蛋白质上的过程。由于N-糖基转移酶只能识别特定的氨基酸基序Asn-X-Thr/Ser（X可以是除脯氨酸之外任何氨基酸）进行修饰，

LC-MS/MS蛋白质组学分析

LC-MS/MS蛋白质组学分析-详情"基于液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学可以揭示定量蛋白质组的状态，从而提供深入了解相关细胞或组织生物化学状态的机会。蛋白质并不是孤立的分子而是具有三维结构的物质，并且协同其他蛋白质分子一起参与调控各种生命活动，它们的空间结构和模块构成与其表达水平同样重要。基于LC-MS/MS的蛋白质组学方法结合生物化学手段，对于研究蛋白质组的结构单位有很大帮助作用。目前，随着高校液相色谱